课题3   血红蛋白的提取和分离

一、实验原理

1．凝胶色谱法：

（1）依据：蛋白质相对分子质量的大小

（2）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

⑶凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

2．缓冲溶液

（1）组成：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H₂CO₃－NaHCO₃， NaH₂PO4/Na₂HPO₄等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

3．电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳：在加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二、实验步骤

1．样品处理

①     红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

②血红蛋白的释放  

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

2．粗分离

①分离血红蛋白溶液   

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

②透析   

透析可以去除样品中分子量较小的杂质

3．纯化：凝胶色谱法分离

4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）

三、注意事项

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出.